“新冠“来袭,您的“蛋白酶K” OK还是KO!

2020.05.15

 


近日,“新型冠状病毒肺炎”在全球范围内爆发,作为“新型冠状病毒”检测金标准的核酸检测试剂盒供不应求;试剂盒中用于检测样本前处理的重要组分,蛋白酶K更是“一K难求”。那今天我们就来说说这个“蛋白酶K”是个什么东东!


 


蛋白酶K的发现

蛋白酶K是一种重要的丝氨酸蛋白酶,由林伯氏白色念球菌分泌。1974年,Wolfgang Ebeling等利用沉淀、离子交换层析和凝聚层析等方法在林伯氏白色念球菌的培养基中分离纯化出蛋白酶K。

 

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1  蛋白酶K三维结构


 


蛋白酶K的性质

蛋白酶K作为丝氨酸蛋白酶,具有广泛的底物特异性和较高的蛋白水解活性,能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键,常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所特有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca2+结合位点增加其稳定性,使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。

 

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2  蛋白酶K关键催化位点



 


蛋白酶K的重要性

蛋白酶K在体外诊断、药物加工等生物医药领域有着不可替代的重要作用。长期以来,我国无法生产医药级别的蛋白酶K,下游产业严重依赖进口。近期由于海外新冠肺炎疫情迅速发展,蛋白酶K作为病毒核酸检测的核心战略资源被美国限制出口,导致国内严重缺货,“卡脖子”效应明显。

 


蛋白酶K的应用

在核酸提取检测中的应用:DNA通常缠绕在由组蛋白和其他非组蛋白形成的染色体上,很难释放出来。蛋白酶K可降解与核酸紧密结合的组蛋白,将DNA与蛋白质的分离,使得DNA更好的被提纯;另外,蛋白酶K可降解RNA水解酶活性(Rnase),抑制Rnase水解模板RNA,在RNA的提取和检测过程中起到不可或缺的作用。

在原位杂交中的应用:蛋白酶K通常用来消化靶标DNA周围的蛋白质,以便于检测探针的穿透,提高检测的敏感性。但是蛋白酶K的浓度和消化时间都会影响杂交效果。浓度过高或消化时间过长,都会破坏细胞结构,出现细胞核消失及脱片等现象,影响核酸的结合。

在非蛋白组分提取中的应用:蛋白酶K可降解蛋白质类杂质,更好的将目标组分和来自生物样本中的蛋白质进行分离,提高产物的纯度和生产效率,尤其可以降解内毒素等蛋白质类有害成分,提高产品安全性。



蛋白酶K的生产

瀚海新酶通过生物信息学分析、分子改造等技术手段成功筛选到一株具有较高有机溶剂耐受性的蛋白酶K突变体;构建了高产蛋白酶K的毕赤酵母工程菌株,优化工程菌发酵、酶纯化、产品后处理和冻干等工艺,提升蛋白酶K的生产效率,实现了蛋白酶K千克级生产,已成为国内最大的蛋白酶K生产商。通过酶定向改造技术与工艺优化,瀚海新酶蛋白酶K对于异硫氰酸胍溶液的耐受性明显提升。

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图3  对异硫氰酸胍的耐受性




瀚海新酶立志成为国际一流的特种酶产品与服务商,瞄准的就是像蛋白酶K这样的高难度产品。不仅是要做到产品质量一流,还要做到产量一流,目标就是为“新型冠状病毒”检测试剂盒的中国制造打上我们自主核心原料供应商的烙印。

同时我们也正在开发“新型冠状病毒”核酸检测试剂盒其他酶原料以及dNTP原料。

相信在中国体外诊断行业各企业的共同努力下,中国制造体外诊断产品能够为全球抗疫贡献中国力量,绝不会因为核心原料短缺而被K.O.

全球责任,我们共担!