重组胰蛋白酶大肠杆菌的发酵与表达？

胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶家族的重要成员,广泛应用于食品生产、制药、临床诊断、生化检测等方面。在基因工程胰岛素的生产中,胰蛋白酶能将胰岛素原酶切为有活性的胰岛素。目前胰蛋白酶主要从猪、牛的胰脏中提取,但因其动物源性,存在未知病毒和外源因子污染的风险,且常因分离纯化不彻底,存在其它酶类(如糜蛋白酶等)对底物非特异性酶切的危险,故此种方法产生的胰蛋白酶在胰岛素等蛋白药物的生产和分析中的应用受到较大的限制。通过基因重组技术获得工程菌来表达胰蛋白酶原,可以产生高纯度与高活力的胰蛋白酶,满足蛋白质研究与药物蛋白生产的需要。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早,目前应用最广泛的表达系统。本文旨在探讨胰蛋白酶在大肠杆菌中的表达,为其工业化生产及应用提供研究基础。本试验首先对NCBI中公布的胰蛋白酶原基因序列进行了密码子偏爱性优化,将经过优化的胰蛋白酶原基因片段合成后连入p ET-22b(+),构建载体p ET22b-Trypsinogen,对载体进行酶切和测序验证后,再将载体转入宿主菌E.coli BL21(DE3),获得表达胰蛋白酶的工程菌,菌种命名为p ET-pro TYP。然后,本试验对工程菌的形态和生化特征进行了研究,并对工程菌传代稳定性进行了全面考察,以确定工程菌在今后的使用中能够稳定传代并表达目的蛋白。