EBC新品发布 | 见微知著，让DNases & RNases无所遁形

近年来，mRNA合成技术的应用越来越广泛，对mRNA疫苗、药物研究和生产过程中质量控制的要求也在不断提高。脱氧核糖核酸酶(DNases)和核糖核酸酶(RNases)是普遍存在于环境和许多生物材料中的一类酶。它们可以降解DNA或RNA，对许多涉及DNA及RNA的研究和生产过程造成影响。由于mRNA分子的脆弱性，抑制或消除研究、生产环境中的核酸酶活性显得极为重要。

对于研发与生产环境以及原料中的DNases与RNases残留，由于其含量处于一个未知状态，检测其存在的方法是否有足够的灵敏度成为一个难题；同时还要考虑到检测的时效性，不能影响相关研发与生产进度。

为此，我们需要一种快速、灵敏的方法来检测环境（如实验台面，移液器吸头、储液袋、反应器等耗材）及物料（如抗体、酶、缓冲液）中的核酸酶活性，判定是否存在DNases或RNases污染，同时能够定量评估污染的程度，从而制定相应的清除方案以达到研发与生产条件的需求。

界定无污染的方法，在《USP43》、《EP10》及《中国药典2020版》等文件中尚无明确规定。核酸水解-紫外分光光度法定量限仅为0.01U/μL，不适合微量核酸酶的活性检测。核酸水解-凝胶电泳法受实验人员的主观判断影响较大，无法准确定量，另外操作时间长也降低了测定通量。高效液相色谱(HPLC)及电化学法等，则耗时费力，且受限于仪器设备。

对此，有研究人员[1]提出了荧光探针法，不仅灵敏度高、检测速度快，且能实现核酸酶活性的定量检测。而DNase/RNase荧光探针法检测试剂盒正是最佳选择之一。

瀚海新酶经过反复摸索与不断优化，推出HS-DNase检测试剂盒（荧光探针法）与HS-RNase检测试剂盒（荧光探针法），全面满足DNases与RNases检测中的高灵敏度与时效性问题。

该高灵敏度检测试剂盒为国内首次推出！

检测原理：

DNase和RNase检测试剂盒的原理相同。

设计出标记有荧光基团的DNA探针和RNA探针，与测试样本混合。

当样本中不含DNases或RNases活性时，该探针稳定存在，荧光基团和淬灭基团距离较近，由于荧光共振能量转移原理，不会产生荧光信号；

当样本中含有DNases或RNases活性时，探针被降解，荧光基团和淬灭基团相互远离，从而产生逐渐增强的荧光信号；

荧光增加的速率与酶的数量和活性成正相关。

原理如下图所示：

荧光探针法原理示意图

DNase/RNase检测试剂盒反应曲线示意图

产品展示：

HS-DNase检测试剂盒（荧光探针法）

适用范围：

用于检测科研和生产过程中环境、物料等的DNase污染情况

产品特点：

灵敏度高：检出限低至1.25×10-6U/μL（DNase I），为现有检测方法1/8

时效性高：反应30分钟即刻获得检测结果

灵敏度优于凝胶电泳法

HS-DNase检测试剂盒与核酸水解-凝胶电泳法对比，测定相同的低浓度酶样本，如图所示。

HS-DNase检测试剂盒测定3×10-5U/μL DNase I，与0浓度可明显区分

电泳法测定DNase I，9/10通道(3×10-5U/μL)与1~8通道(≤3×10-6U/μL)、17通道阴性对照不能明显区分。

灵敏度优于同类荧光探针法

与同类型方法（荧光探针法）相比，HS-DNase检测试剂盒检测下限低至其1/8

样本浓度为6.25×10-6U/μL时，同类型方法DNase检测试剂盒与阴性对照区分不明显

样本浓度为6.25×10-6U/μL时，HS-DNase检测试剂盒与阴性对照可明显区分

低浓度DNase I（1×10-6~10×10-6U/μL）时，同类型方法DNase检测试剂盒测出的S/N值接近1，HS-Dnase检测试剂盒呈倍数增加

HS-DNase检测试剂盒主要组成：

HS-DNase检测试剂盒组分

注：标准品为DNase I，其活性单位定义为：在DNase I反应缓冲液中，37℃条件下10分钟内能够完全降解1µg pBR322 DNA所需的酶量[1]，一个DNase I活性单位相当于0.3 Kunitz单位[2]。

Q&A

HS-DNase检测试剂盒的反应温度和时间是怎样的？

请将反应体系置于37℃恒温条件下进行实验，反应时间为30分钟。

什么情况下可能出现假阳性或假阴性结果或定量结果不准确？

a.凝胶缓冲液、高浓度的粘性物质、表面活性剂和深色溶液可能干扰荧光基团发光；

b.如果待测样本溶液中含有抑制DNA酶活性的物质，则测定结果为样本溶液的整体酶活性，而不是其中的酶的活性。这些物质包括：

•高离子强度溶液（如5M NaCl、20x SSC、3M乙酸钠等）

•pH<4或pH>9的缓冲液

•离液剂、洗涤剂、螯合剂或任何使蛋白质变性的溶液（如SDS、硫氰酸胍、尿素、EDTA等）

c.引起DNA探针化学性质不稳定性的溶液，如pH>9的溶液、苛性溶液（强酸强碱、漂白剂等）。

制备标准品溶液时，前面的步骤为什么要用标准品稀释液稀释而不是用无DNase无RNase水稀释？

因为标准品在标准品稀释液中比较稳定，即使多次稀释也不会改变它本身的活性。如果用水稀释，多步操作可能会造成标准品的活性改变，标准曲线产生偏差。

如何调节合适的酶标仪增益值？

如您的酶标仪有自动增益选项，则选用自动增益。如您的酶标仪没有自动增益选项，则根据增益值范围先设置中间值，然后根据反应后阳性对照孔（79μL无DNase无RNase水+1μL DNase I标准品）的荧光值来调节合适的增益值：如超过仪器上限，则适当降低增益值，如远低于仪器上限，则适当调高增益值。

为什么严重污染的样本可能会出现假阴性的结果？

判定DNase污染的标准是：RFU30(待测样本)≥2×RFU0（待测样本），即反应30分钟时的RFU值达到0分钟的RFU值的2倍以上。如果样本被严重污染，则有可能反应开始时速度很快，在非常短的时间测到一个很高的RFU0值，出现RFU30(待测样本)＜2×RFU0(待测样本)的假阴性结果。此时需要用无DNase无RNase水来稀释待测样本。

阴性对照的RFU值不为0，就说明阴性对照被污染了吗？

不一定。阴性对照通常也能够测到较低的RFU值，但不会随着反应时间的延长值显著增加，一般认为30分钟的RFU30小于0分钟的RFU0的2倍就说明阴性对照没有被污染。

产品信息：

RNase检测试剂盒（荧光探针法）

适用范围：

用于检测科研和生产过程中环境、物料等的RNase污染情况。

产品特点：

灵敏度高：检出限低至RNase A：0.313pg/mL，约1.56×10-9U/μL，为同类型方法检测试剂盒的1/8

时效性高：反应30分钟即刻获得检测结果

灵敏度优于凝胶电泳法

HS-RNase检测试剂盒与核酸水解-凝胶电泳法对比，测定相同的低浓度酶样本，如图所示。

HS-RNase检测试剂盒测定RNase A，2.5×10-8U/μL与0浓度可明显区分。

电泳法测定RNase A，1~8通道(5×10-8U/μL)与17、18通道(2.5×10-8U/μL)、19通道阴性对照无法区分。

灵敏度优于同类型检测方法

与同类型检测方法（荧光探针法）相比，HS-RNase检测试剂盒检测下限低至其1/8

样本浓度为3.13×10-9U/μL时，同类型方法RNase检测试剂盒与阴性对照区分不明显

样本浓度为3.13×10-9U/μL时，HS-RNase检测试剂盒与阴性对照可明显区分

低浓度RNase A（1×10-6~10×10-6U/μL）时，

同类型检测方法RNase检测试剂盒测出的S/N值为1-2之间，HS-RNase检测试剂盒呈倍数增加。

HS-RNase检测试剂盒主要组成：

注：标准品为RNase A，其活性单位定义为：酵母RNA在pH5.0和37℃条件下，260nm处的吸光度增加1.0对应的酶量[3]，50个RNase A活性单位相当于1个Kunitz单位[4]。

Q&A

HH RNase检测试剂盒的反应温度和时间是怎样的？

请将反应体系置于37℃恒温条件下进行实验，反应时间为30分钟。

什么情况下可能出现假阳性或假阴性结果或定量结果不准确？

a.存在可能干扰荧光基团发光的物质，可能导致假阴性结果；

b.如果待测样本溶液中含有抑制RNA酶活性的物质，可能导致假阴性结果

c.引起RNA探针化学性质不稳定性的溶液，可能导致假阳性或假阴性结果

制备标准品溶液时，前面的步骤为什么要用标准品稀释液稀释而不是用无DNase无RNase水稀释？

因为标准品在标准品稀释液中比较稳定，即使多次稀释也不会改变它本身的活性。如果用水稀释，多步操作可能会造成标准品的活性改变，标准曲线产生偏差。

如何调节合适的酶标仪增益值？

如您的酶标仪有自动增益选项，则选用自动增益。如您的酶标仪没有自动增益选项，则根据增益值范围先设置中间值，然后根据反应后阳性对照孔（79μL无DNase无RNase水+1μL RNase A标准品）的荧光值来调节合适的增益值：如超过仪器上限，则适当降低增益值，如远低于仪器上限，则适当调高增益值。

为什么严重污染的样本可能会出现假阴性的结果？

判定RNase污染的标准是：RFU30(待测样本)≥2×RFU0（待测样本），即反应30分钟时的RFU值达到0分钟的RFU值的2倍以上。如果样本被严重污染，则有可能反应开始时速度很快，在非常短的时间测到一个很高的RFU0值，出现RFU30(待测样本)＜2×RFU0(待测样本)的假阴性结果。此时需要用无DNase无RNase水来稀释待测样本。

阴性对照RFU值不为0，就说明阴性对照被污染了吗？

不一定。阴性对照通常也能够测到较低的RFU值，但不会随着反应时间的延长而RFU值显著增加，一般认为30分钟的RFU30小于0分钟的RFU0的2倍就说明阴性对照没有被污染。

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