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技术指标
外观:白色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥4 U/mg酶粉;过氧化氢酶:≤0.03%;肌酐酶:≤0.01%;肌氨酸氧化酶:≤0.01%;NADH氧化酶:≤0.01%
酶学性质
来源:微生物;分类:EC 3.5.3.3;分子量:48 kDa (SDS-PAGE);等电点:4.6;Km值:1.7×10-2 M(Creatine);抑制剂:Ag+,Cu2+,Hg2+;最适:pH 7.5;最适温度:45-50℃;pH稳定性4.5-10.0(25℃,16 h);热稳定性 50℃ 以下稳定(pH 7.5,30 min);稳定性:-25~-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:EDTA及糖类物质
用途
水解肌酸,用于酶法肌酐试剂的研发和大量配制。
尿素(Urea)和 DAB(ρ-dimethylaminobenzaldenhyde)反应形成的黄色染料的量可通过分光光度计在 435 nm 检测。
酶活定义
单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化反应生成 1μmol 肌酸完全转化为肌氨酸所需的酶量。
试剂准备
试剂I:0.1 M 肌酸溶液。
试剂II:将 2.0 g DAB 溶解在 100 mL 二甲亚砜中,并加入 15 mL 浓盐酸。
酶稀释液:50 mM PBS,pH 7.5, 样品用酶稀释液将酶稀释至 2.0-3.0 U/mL。
操作步骤
1. 取 1 mL 试剂I于 5 mL EP 管中,37℃ 预热 5 min。
2. 加入0.1 mL 酶液,混匀。
3. 37℃ 水浴反应 10 min 后,加入 2.0 mL 试剂II终止反应,并在 25℃ 放置 20 min。
4. 使用紫外分光光度计,测定反应液在435nm处吸光度值。
5. 酶稀释液代替酶液作为空白对照。
活力计算
3.1:反应液总体积(mL);
0.1:酶液体积(mL);
10:反应时间(min);
1.0:光路长度(cm);
df:稀释倍数;
C:酶浓度 (mg/mL);
0.321:黄色染料在 435 nm 处毫摩尔吸光系数 (cm2/μmol)。
肌酐酶法是用肌酐酶催化肌酐后,据其水解物的测定来测定血肌酐值的方法。由于酶是在活细胞内产生的一种蛋白质,在细胞内或分泌到细胞外起同样的催化作用。酶是生物体进行新陈代谢必不可少的物质,虽然酶法成本高,但由于酶相对特异性好,目前多采用酶法测定血肌酐值。由于医院的不同、试剂的不同、测定仪器的不同,故测定血肌酐值参考值范围也不同。因此,检查血肌酐值的正常与否及其前后对照,要在同一个医院进行测定与比较。
目前对肾功能肌酐的检测,多采用肌酐酶法,测定值较可靠,肌酐偏高的原因很多,主要表现为肾功能损害、肾小球滤过率降低,较常见的原因有慢性肾炎、高血压肾病、糖尿病肾病、肾缺血、尿路梗阻、肝炎、感染、肿瘤、免疫系统疾病等。要到医院进行诊治,明确诊断后,进行有针对性的治疗,防止肾功能恶化。
目前肌酐酶法的测定主要有两种,一种是监测肌酐亚氨水解酶偶联谷氨酸脱氢酶变化的酶动力学测定,另一种为肌酐氨基水解酶偶联肌氨酸氧化酶和过氧化物酶发生ChemicalbookTrinder反应的酶动力学测定。其中,后者由于试剂价格相对较低,不受血氨和其他干扰物的影响,目前已有大量的商品试剂盒供应。
肌酐酶能将肌酐转化成肌酸。在临床检测上,它和肌酸酶、肌氨酸氧化酶一起用于肌酐酶法检测。
化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子(hM),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。
肌酸酶是催化肌酸水解的同型二聚体。它由两个单体亚基和两个定义的结构域(N末端域和C末端域)组成。C末端折叠在两个结构相似的域内具有α螺旋和反平行β片。在这两个结构域之间,有一个巯基充当活性位点,并且活性与金属无关。
肌酸酶与肌氨酸氧化酶混合可用于测定不同pH值、温度、酶比和缓冲液浓度下的肌酸水平。也可以通过使用离心分析仪来测定血浆肌酐水平。
肌酸脒基水解酶是酶促方法检测肌酐含量的必不可少的酶,它能够将肌酸转化成肌氨酸和尿素,进一步生成能够进行化学检测的过氧化氢。该酶主要来源于微生物,目前已被广泛应用于医疗诊断、有机合成等行业。
肌酸脒基水解酶用于工业上测定肌酐含量,除此之外,也经常被用于临床分析诊断血清和尿液中肌酐含量和与健康机体中肌酐含量不同的肾脏疾病。肌酐是应用人体磷酸肌酸代谢的最终产物,经肾脏过滤后,再从血液中进入尿液,排出体外。
肌氨酸氧化酶简称SOX,是肌酐降解代谢途径中的第三个酶,能专一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。肌氨酸氧化酶在临床诊断中有广泛的应用,通过肌氨酸氧化酶偶联肌酐酶、肌酸酶测定血清中肌酐的含量,是判断肾脏功能的一个重要参考指标,在医药领域具有良好的应用前景。