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技术指标
外观:白色无定型冻干粉末;蛋白纯度:≥90%;比活性:≥25 U/mg酶粉;葡萄糖6磷酸脱氢酶:≤0.01%;乳酸脱氢酶:≤0.005%;谷氨酸脱氢酶:≤0.001%;苹果酸脱氢酶:≤0.01%;己糖激酶:≤0.01%
酶学性质
来源:微生物;分类:EC 1.1.1.50;分子量:30 kDa(SDS-PAGE);等电点:5.2;Km值:3.6×10-5 M(雄酮),4.7×10-5 M(NAD+);抑制剂:Cu2+,Ag+,Hg2+,Zn2+,Fe3+;最适pH:8.5-9.5;
最适温度:55℃;pH稳定性:6.0-9.0(25℃,16 h);热稳定性:37℃以下稳定(pH 9.0,30 min);稳定性:-25~-15℃静置保存12个月保持90%以上活性;保护剂:BSA.
用途:用于总胆汁酸(TBA)试剂的研发和大量制备。
酶活定义:单位酶活定义为在下述条件下,每分钟催化生成1μmol NADH所需的酶量。
试剂准备
试剂I:0.1 M焦磷酸钠(用HCl调pH至8.9)。
试剂II:将319 mg NAD+溶解至25 mL双蒸水中,用固体NaHCO3调节pH至7.0-7.5,用双蒸水定容至30 mL。
试剂III:将30mg溶解至100mL甲醇中。
酶稀释液:10mM Tris-HCl,pH 9.0。
操作步骤
1.向3 mL比色皿中依次加入2.6 mL试剂I,0.2 mL试剂II,0.1 mL试剂III,混匀。
2.将反应混合物在25℃预热5 min。
3.向反应混合物中加入0.1 mL酶液,混匀,
25℃反应,并用分光光度计在340 nm下,记录1 min内的吸光度变化(ΔAs)
*用酶稀释液替代酶液,其它步骤相同,所得溶液吸光度为空白吸光度(ΔAb)ΔA=ΔAs-ΔAb
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶以酵母为原料,EDTA抽提后,DEAE纤维柱层析除核酸,再经磷酸纤维素层析、CM-Sephadex层析,最后结晶得产品。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(英语:glucose-6-phosphatedehydrogenase,EC1.1.1.49)是一种以NAD+或NADP+为受体、作用于供体CH-OH基团上的氧化还原酶。这种酶能催化以下酶促反应:葡萄糖-6-Chemicalbook磷酸脱氢酶主要参与磷酸戊糖途径,也能缓慢地作用在β-D-葡萄糖等其他糖类上。这种酶可由其底物葡萄糖-6-磷酸激活,如果人类表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因G6PD有缺陷,将会导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症,引发非免疫性溶血性贫血。
葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏症,是临床上一种溶血性疾病,主要是一种遗传性溶血性疾病,临床上主要表现为溶血性贫血的临床症状,例如贫血,黄疸等。有的在进食蚕豆后可以诱发溶血性贫血,有的在某些药物,例如非甾体类抗炎药,磺胺类药物等诱发溶血性贫血。因此,葡萄糖六磷酸脱氢酶缺乏的患者,禁忌进食蚕豆以及某些导致溶血的药物。
G-6-PD来源于红细胞,催化葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,生成的NAD-PH是谷胱甘肽还原酶的辅酶,还原型谷胱甘肽(GSH)是保持血红蛋白稳定性及红细胞膜完整性的必要条件。红细胞G-6-PD缺乏者,红细胞膜失去巯基保护而功能受损,终致溶血。G-6-PD缺乏(陷)基因在X染色体上,通过女性遗传,男性患者居多。
神经鞘磷脂酶(sphingomyelinase,SMase)是一种可以作用于鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的水解酶。SMase可以水解质膜表面鞘磷脂的磷酸二酯键,产生神经酰胺(ceramide)和磷酸胆碱。当前,人们对SMase的分泌机制尚不清楚,细胞可能是通过自分泌或旁分泌方式将SMase释放到细胞表面,并水解细胞表面的SM,再进一步启动初始信号的转导。
己糖激酶(hexokinase,HK)是一种转移酶,专一性不强,受葡萄糖-6-磷酸和ADP的抑制,Km(米氏常数)小、亲和性强,可以针对多种六碳糖进行作用。
己糖激酶为催化己糖6位上由ATP使之产生磷酸化反应的酶。EC2.7.1.1。其反应过程是:己糖ATP→己糖-6-磷酸ADP,对α-D葡萄糖的亲和性很高(Km=1×10-5M),对其他的己糖也可进行磷酸化。此反应的平衡向右偏移。△G°’=4.0千卡。该酶广泛存在于以糖为能源的细胞,但在酵母、肝脏、肌肉、脑等最多。该酶可被结晶化。分子量约为9万6千(酵母己糖激酶)。可被Mg2、K所活化,但可被HS试剂阻抑。动物的己糖激酶是作为同功酶而存在的。
己糖激酶目前已知有4种不同的型态,这些型态差异是来自相同基因的选择性剪接,也就是将基因上的外显子(由内含子隔开的部分)重新组合。此外在不同类型的细胞中,也有许多功能或结构与己糖激酶相似的酵素,包括己糖激酶I、己糖激酶II、己糖激酶III,以及与前三者差异较大的己糖激酶IV(又称为葡萄糖激酶)。这类酵素称为同工酶,它们拥有相同的作用,但是却是由不同的基因所制造。
己糖激酶以两种不同的形式从酵母细胞中分离出来,称为PI和P-II。这些是独立的、不可相互转化的同工酶
己糖激酶用于测定葡萄糖、果糖、甘露糖和ATP。
来自酵母的己糖激酶的特性:分子量:天然形式的分子量约为100,000,由分子量略高于50,000的多肽链组成。
最佳pH值:7.5-9.0。
组成:PI和P-II都含有相同的氨基末端缬氨酸和相同的羧基末端丙氨酸。Schmidt等人已经报道了氨基酸组成。(1973b)。
己糖激酶(Hexokinase)是生物体呼吸代谢过程中的关键酶之一,具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有细胞中,是细胞产生能量所需要的一种酶,共有 5 种亚型,其中 I 和 II 分布在线粒体外膜,与电压依赖性阳离子通道蛋白结合;这种部位让己糖激酶能直接获得线粒体产生的 ATP,ATP是己糖激酶的底物之一。
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