本试剂盒采用双抗体夹心法原理，并偶联生物素-链霉亲和素系统，用于定量检测样本中双链RNA(dsRNA)含量，检测的 dsRNA长度40bp 及以上, 检测的 dsRNA与其核酸序列无关。酶标板微孔中包被抗dsRNA抗体，加入样本后孵育洗涤，再加入生物素化检测抗体孵育，形成抗体-抗原-抗体复合物，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(streptavidin，SA）。经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，经酸的终止作用转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中dsRNA含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，根据标准曲线计算样品中 dsRNA浓度。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| dsRNA定量检测试剂盒 | HBP003800 | 48T |
| HBP003801 | 96T |
产品性质
本试剂盒用于定量检测样本中 dsRNA的含量。
运输及保存方法
1. 试剂盒于 2~8℃储存，避免强光直射，有效期24个月。
2. 包被条拆封使用后，应将剩余包被条密封，在2~8℃储存，在有效期内使用。
3. 试剂盒其他组分使用后要及时放回到 2~8℃条件，在有效期内使用。
试剂盒组成
| 组分 | HBP003800 | HBP003801 | |
|---|---|---|---|
| 1 | 反应板 | 8×6孔 | 8×12孔 |
| 2 | 生物素化检测抗体(100x) | 60μL | 120μL |
| 3 | HRP-链霉亲和素(100x) | 60μL | 120μL |
| 4 | 稀释液 | 15mL | 30mL |
| 5 | 显色剂 | 6mL | 12mL |
| 6 | 终止液 | 3mL | 6mL |
| 7 | 浓缩洗涤液(20x) | 20mL | 40mL |
| 8 | dsRNA标准品(无修饰,5ng/μL) | 7.5μL | 15μL |
| 9 | dsRNA标准品(pUTP修饰, 5ng/μL) | 7.5μL | 15μL |
| 10 | dsRNA标准品(N1-Me-pUTP修饰,5ng/μL) | 7.5μL | 15μL |
| 11 | dsRNA标准品(5-OMe-UTP修饰,5ng/μL) | 7.5μL | 15μL |
| 12 | STEbuffer | 25mL | 50mL |
| 13 | 封板膜 | 2张 | 4张 |
| 14 | 说明书和COA | 各1份 | 各1份 |
所需仪器和试剂
1. 酶标仪(含450nm波长，建议含有双波长检测模式，主副波长分别为450nm和 650nm)。
2. 微孔板摇床
3. RNase-free枪头和 EP管
检测流程图
实验前准备
1. 将本次实验所用试剂平衡至室温(18-25℃)
2. 20×浓缩洗涤液用纯化水按 1：19 体积比稀释成洗涤工作液。
3. 将抗体管、HRP-SA 管和标准品管 1000rpm 在使用前离心30s，以避免管壁及管盖上残留试剂。
4. 将 100×生物素化检测抗体和 100×HRP-链霉亲和素在使用前用稀释液作100倍稀释后使用。
5. 无修饰、pUTP修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0 pg/μL。N1-Me-pUTP修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0 pg/μL。5-OMe-UTP修饰 dsRNA 标准品用 STE buffer 稀释至 4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 pg/μL。稀释方法建议如下：
无修饰、pUTP修饰
| 编号 | 终浓度 (pg/μL) | STE buffer | 工作标准品 |
|---|---|---|---|
| 100 | 49 μL | 1 μL 5 ng/μL 标准品 | |
| A | 1 | 495 μL | 5 μL 100 pg/μL 溶液 |
| B | 0.5 | 250 μL | 250 μL A溶液 |
| C | 0.25 | 250 μL | 250 μL B溶液 |
| D | 0.125 | 250 μL | 250 μL C溶液 |
| E | 0.0625 | 250 μL | 250 μL D溶液 |
| F | 0.0312 | 250 μL | 250 μL E溶液 |
| G | 0.0156 | 250 μL | 250 μL F溶液 |
| H | 0 | 250 μL | / |
N1-Me-pUTP修饰
| 编号 | 终浓度 (pg/μL) | STE buffer | 工作标准品 |
|---|---|---|---|
| 100 | 49 μL | 1 μL 5 ng/μL 标准品 | |
| A | 2 | 490 μL | 10 μL 100 pg/μL 溶液 |
| B | 1 | 250 μL | 250 μL A溶液 |
| C | 0.5 | 250 μL | 250 μL B溶液 |
| D | 0.25 | 250 μL | 250 μL C溶液 |
| E | 0.125 | 250 μL | 250 μL D溶液 |
| F | 0.0625 | 250 μL | 250 μL E溶液 |
| G | 0.0312 | 250 μL | 250 μL F溶液 |
| H | 0 | 250 μL | / |
5-OMe-UTP修饰
| 编号 | 终浓度 (pg/μL) | STE buffer | 工作标准品 |
|---|---|---|---|
| 100 | 49 μL | 1 μL 5 ng/μL 标准品 | |
| A | 4 | 480 μL | 20 μL 100 pg/μL 溶液 |
| B | 2 | 250 μL | 250 μL A溶液 |
| C | 1 | 250 μL | 250 μL B溶液 |
| D | 0.5 | 250 μL | 250 μL C溶液 |
| E | 0.25 | 250 μL | 250 μL D溶液 |
| F | 0.125 | 250 μL | 250 μL E溶液 |
| G | 0.0625 | 250 μL | 250 μL F溶液 |
| H | 0 | 250 μL | / |
检测步骤
1. 从室温平衡后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条加盖封板膜后用自封袋密封放回 2~8℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品100μL，样本孔中加入待测样本100μL。
*当不能够确定待测样品中的dsRNA 含量时，应当用STEbuffer做多个稀释倍数做检测，以免含量过高不能够读取有效数值。
3. 用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm)反应60min。
4. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250 μL)，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次。
5. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的生物素化检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm)反应60min。
6. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250 μL)，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4次。
7. 标准品孔和样本孔中每孔加入工作浓度的 HRP-链霉亲和素100μL，用封板膜封住反应孔，室温下振板(500rpm）反应30min。
8. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(250 μL)，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 4次。
9. 每孔加入单组分底物显色液 100μL，用封板膜封住反应孔，室温静置避光反应 30min。
10. 每孔加入终止液 50μL，立即进行检测，设定酶标仪波长于 450nm 处 ( 建议用双波长450nm/650nm）。
检测结果的解释
1. 取标准品、空白对照、样本的平均光吸收值，减去空白对照的平均光吸收值，得到标准品、样品的光吸收校准值。以标准品浓度为横坐标，校准后的标准品光吸收值为纵坐标绘制标准曲线（双波长检测模式下的光吸收值为 450 nm 减去 650 nm）。
2. 推荐使用专业的曲线制作软件，如 CurveExpert 1.3 或 ELISACalc（请使用 Logistic 五参数或四参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。
检测性能
1. 检出限：无修饰、pUTP修饰、N1-Me-pUTP修饰 dsRNA 检出限≤0.001 pg/μL，5-OMe-UTP修饰 dsRNA 检出限≤0.01 pg/μL。
2. 定量限：无修饰、pUTP修饰 dsRNA 定量限 0.0156 pg/μL，N1-Me-pUTP修饰 dsRNA 定量限 0.0312 pg/μL，5-OMe-UTP修饰 dsRNA 定量限 0.0625 pg/μL。
3. 精密度：板内变异系数≤10%，板间变异系数≤10%。
4. 回收率：80%~120%。
5. 线性范围：无修饰、pUTP修饰 dsRNA 检测线性范围 0.0156-0.5 pg/μL，N1-Me-pUTP修饰 dsRNA 检测线性范围 0.0312-1 pg/μL，5-OMe-UTP修饰 dsRNA 检测线性范围 0.0625-1 pg/μL。
注意事项
1. 显色温度和时间对实验结果至关重要，应准确把握。若出现按常规操作流程，测值超出仪器可检测范围现象，可适当减少显色时间。
2. 洗涤过程中应使洗涤液浸泡反应板 30s 后再甩干，以充分洗涤非特异性吸附的成分。
3. 所有试剂使用前应充分摇匀，加样时应将所加样物加入酶标板孔中底部，避免加在孔壁上部，加样时注意不可溅出，不可产生气泡。
4. 若发现浓缩洗涤液中有结晶，可在 37℃水浴锅中孵育，待结晶完全溶解后再混匀稀释至工作浓度。
5. 样本中应避免引入叠氮化钠(NaN3），叠氮化钠会破坏辣根过氧化酶活性，使检测值偏低。
6. 实验操作过程中要严格避免RNase污染。
7. 不可使用摇床代替振板机，若无振板机可采用室温静置孵育，但静置孵育会造成检测灵敏度下降一倍左右。建议无修饰、pUTP修饰标准品从 2pg/μ L 开始稀释，N1-Me-pUTP 修饰标准品从 4pg/μL开始稀释，5-OMe-UTP修饰标准品从 8pg/μL开始稀释，HRP-SA孵育时长由30min调整至 60min。
检测实例
1. 标曲测值
| 抗原浓度 (pg/μL) | N1-Me-pUTP修饰标准品 | ||
|---|---|---|---|
| OD450-OD650 (1) | OD450-OD650 (2) | AVERAGE | |
| 2 | 2.8412 | 2.7362 | 2.7887 |
| 1 | 1.8725 | 1.9135 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.0863 | 1.1207 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.623 | 0.6055 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3388 | 0.3292 | 0.3340 |
| 0.0625 | 0.1947 | 0.1885 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0.1192 | 0.1247 | 0.1220 |
| 0 | 0.0567 | 0.0518 | 0.0543 |
2. 标曲五参数 Logistic 曲线拟合
3. 线性范围判断：0.0312-1pg/μL
| 抗原浓度 (pg/μL) | OD450-OD650 |
|---|---|
| 1 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3340 |
| 0.0625 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0.1220 |
4. 样品测值
| 样品 | 上样浓度 | OD450-OD650 | dsRNA浓度（代入标曲） | 结果判断 |
|---|---|---|---|---|
| M6 1989n g/μL | 2ng/μl | 2.3952 | 1.46 | 无效 |
| 0.5ng/μl | 1.1036 | 0.50 | 有效 | |
| 0.1ng/μl | 0.3252 | 0.12 | 有效 | |
| M13 1394n g/μL | 2ng/μl | 2.0294 | 1.11 | 无效 |
| 0.5ng/μl | 0.7030 | 0.29 | 有效 | |
| 0.1ng/μl | 0.1936 | 0.06 | 有效 |
