肽 N-糖苷酶 F 是从糖蛋白中去除几乎所有 N-糖链的最有效的方法。肽 N-糖苷酶 F 是一种酰胺酶，切割糖蛋白上的 N-连接糖链。切割的糖型有：高甘露糖、杂合和复杂寡糖；切割位点为：最内侧的 N-乙酰葡糖胺和天冬酰胺之间的糖苷键。尽可能短的时间内获得准确的N-糖链分布对有效的过程控制至关重要。通常，使用肽 N-糖苷酶 F 水解释放抗体 N-糖链需要几个小时的孵育时间，然后进行聚糖衍生和液相色谱或质谱分析。若去糖基化不完全，获得的糖链分布不能代表治疗性抗体的正确组成。肽 N-糖苷酶 F(快速版)是一种改进的试剂，可以在几分钟内完成抗体和融合抗体的快速去糖基化。所有的 N-糖链都能快速无偏好地释放出来，并准备好进行下游色谱或质谱分析，进而快速的对糖基化抗体确定糖型。
产品信息
| 产品名称 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|
| 肽N-糖苷酶F(快速无甘油版) | HBP003004 |
技术指标
| 外观 | 无色透明液体 |
| 糖苷外切酶 | 无检出 |
| 糖苷内切酶F1 | 无检出 |
| 糖苷内切酶F2 | 无检出 |
| 糖苷内切酶F3 | 无检出 |
| 糖苷内切酶H | 无检出 |
| 蛋白酶 | 无检出 |
酶学性质
| 来源 | 微生物 |
| 分类 | EC3.5.1.52 |
| 分子量 | 35kDa(SDS-PAGE) |
| 等电点 | 8.14 |
| 最适pH | 7.0-8.0 |
| 最适温度 | 65℃ |
| 底物选择性 | 水解蛋白质的 Asn 相连的 N-糖链，使N-聚糖保持完整。 |
| 抗体水解位点 | 完整地水解糖基化抗体的糖链。 |
| 激活剂 | DTT |
| 抑制剂 | SDS |
| 储存温度 | -25～-15 °C |
| 失活条件 | 含1μL 肽N-糖苷酶F(快速版)的20 μL反应混合物在75 °C孵育10min即可失活。 |
图1. 肽N-糖苷酶F的底物特异性
图2. IgG 的结构和可能的糖基化位点，红色箭头表示的是肽N-糖苷酶F的识别水解位点
用途
用于糖基化抗体的快速去糖基化，分离纯化的糖链可用于后续的质谱鉴定抗体的糖型。
试剂组成
| PNGaseF-Fast（Glycerol Free） | 50µl |
| 5 × PNGase F-Fast buffer | 1000µl |
运输和保存方法
运输稳定性： -25~-15℃运输储存稳定性： -25~-15℃储存，产品冻融次数≤5 次，建议首次解冻后小剂量分装储存。解冻后短期使用可于 2~8℃保存，建议时间不超过 30 天。
一步法操作步骤
1. 用去离子水溶解 100 µg 的抗体或糖蛋白，用去离子水定容到 16µl；
2. 加入 4 µl 的 5×PNGaseF-Fastbuffer，轻轻吹打混匀；
3. 加入 1 µl 的 PNGase F-Fast，轻轻吹打混匀；
4. 50 ℃孵育 10min；
5. 衍生后可直接用固相萃取技术分离纯化 N-糖链，用于下游分析糖型。
两步法操作步骤
对于有些糖基化抗体，需要将样品预热处理后能才能完全去糖基化，步骤如下：
1. 用去离子水溶解 100 µg 的抗体或糖蛋白，用去离子水定容到 16µl；
2. 加入 4 µl 的 5×PNGaseF-Fastbuffer，轻轻吹打混匀；
3. 80℃孵育 2 min 后在冰上冷却；
4. 加入 1 µl 的 PNGase F-Fast，轻轻吹打混匀；
5. 50℃孵育 10 min；
6. 衍生后可直接用固相萃取技术分离纯化 N-糖链，用于下游分析糖型。
